CRISPR-Cas разрушила гены шига-токсина кишечной палочки. И облегчила симптомы у зараженных кроликов

И облегчила симптомы у зараженных кроликов

Французские ученые разработали препарат на основе бактериофага, который доставляет систему CRISPR-Cas12 в клетки энтерогеморрагической кишечной палочки. Система фрагментирует ДНК бактерии в области гена шига-токсина, что тормозит развитие инфекции и приводит к снижению колонизации кишечника патогенными бактериями у модельных мышей. Кроме того, такое лечение приводило к облегчению симптомов в модели заболевания у кроликов. Результаты экспериментов описаны в Science Translational Medicine.

Энтерогеморрагические штаммы Escherichia coli (ЭГКП) продуцируют шига-токсин, который связывается с гликолипидным глоботриаозилцерамидным рецептором и проникает в эпителиальные клетки кишечника. В клетке токсин разрушает рибосомальную РНК, что приводит к ингибированию синтеза белка. Считается, что ЭГКП приводит к 2,8 миллиона случаев пищевых отравлений во всем мире, причем чаще всего инфекция поражает детей. Она проявляется диареей (от легкой до кровавой) и может осложнятся гемолитико-уремическим синдромом вплоть до летального исхода.

Примечательно, что лечение антибиотиками повышает риск развития гемолитико-уремического синдрома. По-видимому, это связано с тем, что гены шига-токсина переносятся бактериофагами: они расположены в таких оперонах, что их экспрессия и высвобождение зависят от индукции фаголитического цикла. Так, наблюдалось, что антибиотики повышают концентрацию фагов в культуре в результате разрушения бактериальной клетки, при котором выделяется токсин. Поэтому пациенты, как правило, получают симптоматическое лечение, хотя потребность в разработке стратегий по безопасной элиминации ЭГКП остается актуальной.

Исследовательская группа под руководством Хесуса Фернандеса-Родригеса (Jesus Fernandez-Rodriguez) из биотехнологической компании Eligo Bioscience разработала способ доставки системы CRISPR-Cas12, которая фрагментирует более 99 процентов вариантов гена шига-токсина в клинических изолятах E. coli O157 — ЭГКП. Бактериофаг из семейства сифовирусов модифицировали таким образом, чтобы он специфически связывался с антигеном О157 ЭГКП. После этого вирусные частицы вводили мышам и определяли их количество в образцах кала, чтобы проверить как бактериофаги проходят через желудочно-кишечный тракт. Первичные эксперименты показали недостаточную избирательность вируса, однако его дополнительные модификации позволили преодолеть это ограничение.

Затем ученые разработали систему CRISPR-Cas12a, способную эффективно уничтожать ЭГКП без высвобождения токсина, воздействуя на гены шига-токсина — stx. Для реализации избыточности направляющей РНК исследователи выбрали набор из четырех РНК, нацеленных на ген субъединицы stxA. Получившийся капсид с системой CRISPR-Cas12a получил наименование EB003. Сначала препарат проверили на культуре ЭГКП. Обработка EB003 привела к снижению числа колониеобразующих единиц, что отражало антимикробную активность бактериофага. Примечательно, что максимальное снижение колониеобразующих единиц наблюдалось через час после обработки EB003 и через четыре часа при обработке ципрофлоксацином.

Кроме того, обработка ципрофлоксацином приводила к значительному росту концентрации шига-токсина в культуре, а при воздействии EB003 заметного высвобождения токсина не наблюдалось. Для оценки эффективности EB003 in vivo ученые разработали мышиную модель колонизации кишечника ЭГКП. После введения однократной дозы из 1012 частиц EB003 колонизация уменьшилась в среднем в 3 × 103 раза через восемь часов после обработки (p < 0,0001). Через сутки количество кишечной палочки восстановилось. Поэтому ученые проверили, насколько повторное введение экспериментального препарата будет эффективным для снижения численности патогенных бактерий.

Наиболее эффективным оказался режим дозирования, при котором мышам вводили 1012 частиц каждые 12 часов в течение трех дней. Он позволил достичь и поддерживать снижение колонизации на 99,9 процента в течение всего периода лечения. Через три дня после введения последней дозы содержание бактерий оставалось ниже 106 колониеобразующих единиц на грамм кала. Однако ученые отмечают, что у некоторых бактерий успела выработаться резистентность к бактериофагу.

Для определения клинической эффективности препарата исследователи использовали кроликов. У них лечение бактериофагом с системой CRISPR-Cas12a не только снижало колонизацию ЭГКП, но и облегчало симптомы заболевания. Это выражалось в меньшем повреждении почек и кишечной стенки, а в крови наблюдался меньший уровень C-реактивного белка, что свидетельствовало о снижении интенсивности воспаления. Более того, гистологический анализ показал, что лечение EB003 было связано со значительно меньшим повреждением тканей толстой и подвздошной кишок. Все это свидетельствует о потенциальной эффективности такого метода лечения тяжелой эшерихиозной инфекции, однако для инициации клинических исследований на людях необходимо оценить безопасность нового препарата.

Ранее мы рассказывали об эффективности ex vivo CRISPR-терапии серповидноклеточной анемии и бета-талассемии у детей. У первых пациентов она достигла 100 процентов при хорошей переносимости.

На мышах

Источник: nplus1.ru