Команда использует AlphaFold AI для перепроектирования белков, используемых для редактирования генов, чтобы сделать их более безопасными.

Разработанная Google технология AlphaFold может помочь определить, какие участки белка, участвующего в редактировании генов, приводят к ошибкам.

Фото: Антон Виериетин

Спустя пару десятилетий после открытия систем, способных избирательно воздействовать на ДНК, мы начинаем наблюдать первые методы терапии, основанные на редактировании генов. Одной из проблем, с которыми сталкиваются эти разработки, является безопасность. Хотя мы можем сделать их достаточно специфичными для нужного нам гена, человеческий геном очень велик, и даже редкие последовательности ДНК могут встречаться несколько раз случайно.

В результате все первоначальные системы редактирования генов имели известные показатели так называемых нецелевых эффектов, при которых они просто изменяют неправильную последовательность. Это может быть событием с низкой вероятностью, но при редактировании достаточного количества клеток — а терапия, как правило, требует редактирования большого количества клеток — ошибки становятся неизбежными.

Было приложено немало усилий для поиска способов минимизации или устранения нежелательных изменений. В недавнем выпуске журнала Nature исследователи описали модификацию программного обеспечения AlphaFold для анализа сворачивания белков с помощью искусственного интеллекта, чтобы помочь выявить ключевые области белков, участвующих в редактировании генов, ответственные за нежелательные эффекты. Затем эти области были модифицированы для уменьшения проблем.

Редактирование генов и побочные эффекты

Системы редактирования генов имеют три ключевых компонента. Первый — это направляющая РНК, которая может образовывать комплементарные пары с целевой последовательностью генома. Можно разработать множество направляющих РНК, которые нацелены на один и тот же ген, поэтому один из подходов к повышению безопасности системы заключается в выборе последовательностей, которые не имеют большого сходства с другими участками генома. В настоящее время это широко используется в качестве базового процесса проектирования системы редактирования генов.

Второй компонент — это белок Cas, названный в честь белка Cas9 системы CRISPR. Он взаимодействует как с направляющей РНК, так и с геномной РНК и помогает обеспечить специфичность взаимодействий.

Если в комплементарной связке между РНК и ДНК слишком много несовпадений, Cas9 (или другие члены семейства Cas) не сможет закрепиться на этом участке. Различные подходы привели к улучшению членов семейства Cas, что снизило вероятность внесения нецелевых изменений.

Последним ключевым компонентом системы является белок, который взаимодействует с Cas9, когда тот связан с ДНК, и модифицирует ДНК. В оригинальной системе CRISPR это приводило к разрезанию обеих нитей двойной спирали, вызывая повреждения, которые трудно контролировать. С тех пор исследователи модифицировали другие белки, чтобы они взаимодействовали с Cas9, но катализировали более тонкие изменения в ДНК, такие как отсечение одной основы или внесение химических модификаций, изменяющих способ образования пар оснований.

В целом, длина пары оснований между направляющими РНК и геномом составляет порядка 18 оснований. В случайных последовательностях ДНК такое должно встречаться лишь примерно один раз на 70 миллиардов оснований, а наш геном состоит всего из 3 миллиардов оснований. По этому показателю всё должно быть в порядке. Но оказывается, что Cas9 может допускать небольшое количество неправильно спаренных оснований, не теряя при этом способности связываться с ДНК. Точное количество и расположение оснований, где допускаются вариации, могут несколько варьироваться, что затрудняет предварительное определение того, какие направляющие РНК могут представлять опасность.

Один из способов повышения безопасности — лучше понять, как происходят эти нежелательные взаимодействия.

Установление контакта

Команда, работающая над новой разработкой и базирующаяся в различных учреждениях Китая, заранее продумала свой подход. Идеально подобранный гибрид ДНК-РНК будет иметь одну структуру, в то время как гибрид с одним или несколькими неправильно спаренными основаниями будет иметь немного другую структуру. Эволюция оптимизировала структуру Cas9 таким образом, чтобы она соответствовала первому типу. Но, по-видимому, это не помешало Cas9 принимать немного отличающиеся конформации, которые могут взаимодействовать с неправильно спаренными структурами.

Если мы сможем идентифицировать те участки Cas9, которые опосредуют эти проблемные взаимодействия, мы сможем модифицировать и, возможно, заблокировать их.

Первым шагом команды стало создание обширной библиотеки сайтов внецелевого редактирования. Для этого они использовали модифицированную систему CRISPR, которая преобразует основание ДНК аденин в родственное химическое вещество инозин, а затем изолировали все фрагменты ДНК, содержащие его. Они повторили этот процесс с 10 различными направляющими РНК и проанализировали большое количество модифицированных фрагментов ДНК из каждой из них, чтобы получить общее представление о типах присутствующих внецелевых последовательностей.

Следующим шагом стало изучение взаимодействия комплекса CRISPR с белками с помощью программного обеспечения AlphaFold для моделирования сворачивания белков на основе искусственного интеллекта. Обновленные версии были разработаны для обработки взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами, а также комплексов из нескольких белков. Поэтому команда загрузила в AlphaFold версии целевой последовательности ДНК, а также направляющую РНК, последовательность Cas9 и фермент, который химически модифицирует основания и может связываться с Cas9.

К сожалению, произошел сбой, в результате чего один из белков оказался явно не в том месте.

Не сдаваясь, команда упростила задачу и загрузила в AlphaFold только ДНК, РНК и белок Cas9, поскольку последний является основным фактором, определяющим его специфичность последовательности. Это сработало гораздо лучше, в результате чего была получена структура, совпадающая со структурами, определенными в экспериментах с реальными нуклеиновыми кислотами и белками.

Сравнивая структуры, созданные AlphaFold при воздействии различных целевых и нецелевых участков, исследователи обнаружили общую закономерность. Многие (примерно две трети) нецелевых участков приводили к тому, что белок Cas9 принимал несколько иную структуру. Но почти все (более 95 процентов) из них изменяли аминокислоты, контактирующие с РНК. Таким образом, очевидно, что существуют случаи, когда Cas9 сохраняет свою нормальную структуру, но аминокислоты внутри него изменяются таким образом, чтобы компенсировать неправильно спаренные основания нецелевых участков.

Удобно, что AlphaFold уже был настроен на определение так называемой «вероятности контакта», а именно, вероятности того, что любые два элемента, такие как аминокислоты или нуклеотиды, находятся на очень малом расстоянии (восемь ангстремов). Исследователи могли взять результаты анализа вероятности контакта для целевых и нецелевых участков и сравнить их, точно определив, какие аминокислоты в Cas9 изменили контакты при несоответствии между направляющей РНК и ДНК. Они назвали эту компьютеризированную систему анализа «ContactSeek».

Более точное наведение на цель

Сама по себе программа ContactSeek, как правило, выдавала большой список аминокислот, которые смещались при связывании с нецелевым участком. Поэтому исследователи сосредоточились на областях белка Cas9, где эти аминокислоты группировались, рассматривая это как признак того, что эти области адаптируются к различиям, вызванным несовпадающими основаниями. Затем они начали тестировать версии Cas9 с различными аминокислотами в этих участках.

В общей сложности исследователи произвели 23 различных замены, вставив другую аминокислоту в одну из 10 ключевых позиций, выявленных в ходе их работы с AlphaFold. Это позволило им найти вариант с активностью, аналогичной активности обычного Cas9 в участках, соответствующих целевой последовательности, при этом его внецелевая активность снизилась с 28% до 5%. Аналогичные результаты были получены при использовании различных направляющих РНК. Они также показали, что этот подход работает для аналогичной системы, использующей другой белок Cas (Cas12) для распознавания комбинации ДНК/направляющая РНК.

Как упоминалось выше, другие исследовательские группы использовали различные подходы, такие как направленная эволюция, для разработки вариантов Cas9, менее подверженных нецелевому редактированию. При тестировании на этих вариантах новые версии, как правило, демонстрировали аналогичную или даже немного лучшую активность и специфичность. Главное отличие здесь заключается в том, что изменения, выявленные с помощью этого подхода, могут быть несколько более специфичными для конкретной комбинации направляющей РНК/несоответствия, чем более универсальными.

Конечно, некоторые из выявленных здесь отдельных изменений потенциально могут быть объединены с изменениями в ранее разработанных версиях Cas9 для еще большего улучшения, хотя это здесь не проверялось.

В любом случае, эта работа потенциально полезна, поскольку описывает общий метод создания систем редактирования генов, адаптированных для предотвращения известных нежелательных побочных эффектов. Если это окажется узким местом в разработке терапии, эта работа может стать значительным прорывом. Но исследователи также предполагают, что этот подход будет полезен в более общем плане для тонкой настройки взаимодействий белок-ДНК, что может иметь применение далеко за пределами редактирования генов.

Природа, 2026. DOI: 10.1038/s41586-026-10794-z (О DOI).

Источник: arstechnica.com