Усовершенствованный процесс редактирования генов позволяет повторно активировать фетальную версию гена гемоглобина.
Диаграмма гемоглобина. Автор: Laguna Design. Диаграмма гемоглобина. Автор: Laguna Design. Настройки текста.Текст рассказа Размер Маленький Стандартный Большой Ширина * Стандартный Широкий Ссылки Стандартный Оранжевый * Только для подписчиков
Узнать больше Свернуть в навигацию
Практически сразу после начала изучения возможностей системы CRISPR/Cas9 исследователи осознали ее потенциал для целенаправленного редактирования генов. Однако за прошедшие десятилетия прогресс был медленным, поскольку люди пытались определить, как это сделать безопасным для использования у людей способом. Лишь чуть более двух лет назад, спустя десятилетия после открытия CRISPR, FDA одобрило первую терапию на основе CRISPR для лечения серповидноклеточной анемии.
Теперь, вслед за этим успехом, крупная китайская группа исследователей представила описание усовершенствованной системы редактирования генов, которая позволяет вносить более целенаправленные изменения и допускать меньше ошибок. Они использовали её для создания терапии, направленной на лечение заболевания, тесно связанного с серповидноклеточной анемией: β-талассемии.
Редактирование генов и его ограничения
Система CRISPR/Cas-9 обеспечивает бактериям своего рода иммунитет. Она использует специально структурированные РНК (называемые направляющими РНК), которые могут образовывать комплементарные пары с целевой последовательностью. Затем белок Cas-9 распознает эту структуру и разрезает близлежащую ДНК. Это довольно эффективно, когда направляющая РНК может образовывать комплементарные пары с ДНК-вирусом, поскольку результирующий разрез инактивирует вирус.
Существует несколько способов использования этого метода для редактирования ДНК в таких организмах, как мы. Оба метода основаны на том факте, что системы восстановления ДНК в клетках часто обрезают концы этих разрезов, прежде чем снова соединить их. Это часто приводит к небольшим делециям в месте разреза, которые можно использовать для отключения генов. Размер этих делеций варьируется, поэтому необходимо провести секвенирование ДНК, чтобы найти делецию, которая отключает интересующий вас ген, но не наносит дополнительного вреда.
В качестве альтернативы, любую удаленную последовательность иногда можно восстановить, используя соответствующую последовательность, которая обычно находится на другой копии той же хромосомы. Если разрез, выполненный с помощью CRISPR, сопровождается большим количеством копий модифицированной последовательности, то системы восстановления могут вставить модификации в геном, обеспечивая истинную возможность редактирования. Но опять же, этот процесс подвержен ошибкам, поэтому обычно необходимо отредактировать множество клеток и секвенировать ДНК, чтобы убедиться в правильности внесенных изменений.
Кроме того, существует риск того, что система CRISPR/Cas9 может случайно разрезать похожую последовательность где-то ещё в геноме. Такие нецелевые разрезы могут иметь непредсказуемые последствия, и большинство экспериментов по редактированию генов требуют дополнительного скрининга для исключения любых клеток, в которых они обнаружены.
Именно поэтому первые CRISPR-терапии проводятся на стволовых клетках крови, поскольку их можно выращивать в культуре. Этот подход включает в себя внесение изменений во множество клеток, затем скрининг тех клеток, в которых отсутствуют нежелательные изменения, и отбор тех, в которых целевое изменение привело к желаемому результату. Однако мы пока не видим большого количества примеров редактирования, требующего обработки большого количества клеток в организме, поскольку, если что-то пойдет не так, мы вряд ли сможем это обнаружить или предпринять какие-либо действия, если обнаружим проблему.
Как CRISPR, но лучше.
Тем не менее, была проделана большая работа по созданию более точной версии CRISPR, и новое исследование использует некоторые из этих методов. Один из используемых здесь подходов заключается в отказе от Cas9, поскольку создаваемые им двуцепочечные разрывы являются источником многих непредсказуемых результатов. Вместо этого, эти методы, как правило, включают одно или несколько изменений одной нуклеотидной пары. А другие методы использовались для ограничения активности только одним участком генома, избегая любых нецелевых изменений.
Используемая здесь система включает белок, который химически отщепляет атом азота от основания цитозина (C), превращая его в нечто, образующее пары оснований, более похожие на тимидин (T). Этот белок соединен с белком, способным связываться с направляющей РНК типа CRISPR, нацеленной на выбранную последовательность. Он также присутствует в неактивной форме и требует отдельного фермента (протеазы) для активации. Ключевая часть этого фермента также связана с комплексом направляющей РНК, поэтому фермент, вызывающий мутации, будет активирован только при наличии полного комплекса направляющей РНК.
Одна из сложностей здесь заключается в том, что мутации, создаваемые этой системой — замены C->T — достаточно распространены, поэтому в наших клетках есть ферменты, которые специфически их восстанавливают. Таким образом, еще одним элементом, связанным с комплексом направляющей РНК, является бактериальный белок, который ингибирует эту систему репарации ДНК. По сути, этот комплекс не только создает мутации в определенных местах, но и блокирует их исправление в этих местах.
Таким образом, хотя любая из этих функций — редактор оснований, активирующий его фермент и ингибитор репарации — может временно активироваться в неправильном месте, для создания мутаций необходимо, чтобы все три функции присутствовали в течение некоторого времени. А это, как считается, требует специфического нацеливания на идеальное соответствие последовательности направляющей РНК.
В своей статье исследовательская группа уделила немало времени доказательству этого факта. Они обнаружили, что мутации в целевом участке генерируются с меньшей эффективностью, чем в некоторых конкурирующих системах (примерно на 30 процентов по сравнению с более чем в два раза большей частотой), но преимущество заключается в полном отсутствии внецелевых изменений.
Лечение болезни
β-талассемия вызывается множеством мутаций, и нереалистично полагать, что все их можно исправить с помощью одной системы редактирования. Поэтому исследователи применили подход, который рассматривался десятилетиями: реактивация фетальной версии гена. Эта версия обладает более высоким сродством к кислороду, чем нормальный гемоглобин, что позволяет ей забирать кислород из гемоглобина в кровотоке матери. В норме этот ген отключен у взрослых.
Мы выявили ключевой белок, который специфически связывается с ДНК вблизи гена и необходим для его отключения. В данном случае редактирование гена просто повреждает участок, к которому прикрепляется этот ингибитор, позволяя фетальному гену быть активным у взрослых. Это редактирование было проведено в стволовых клетках крови, полученных от этих пациентов, и только те клетки, которые выросли в результате успешного редактирования без каких-либо побочных эффектов, были пересажены обратно.
Данное клиническое исследование представляет собой лишь базовую проверку безопасности, в которой участвовали всего пять пациентов с β-талассемией. После редактирования их стволовых клеток им была проведена химиотерапия, уничтожающая существующую популяцию стволовых клеток. Эта процедура имеет некоторые заметные побочные эффекты, и все они наблюдались у этих пациентов, но все пятеро оставались участниками исследования как минимум год после трансплантации.
И это сработало. Через несколько недель уровень гемоглобина в крови начал повышаться, и все пациенты достигли ключевого показателя успеха исследования: более шести месяцев без необходимости переливания крови для контроля β-талассемии.
В целом, самая большая проблема, которую видят исследователи в этом подходе, — это дороговизна. Все этапы культивирования клеток и секвенирования ДНК обходятся недешево, а протокол трансплантации включает в себя значительные медицинские вмешательства. И ни один из этих этапов нельзя пропустить без ущерба для безопасности. В долгосрочной перспективе, учитывая необходимость постоянного медицинского обслуживания людей с β-талассемией, вполне возможно, что это компенсируется. Нам придется подождать некоторое время, чтобы узнать об изменениях в качестве жизни, но они, вероятно, также будут значительными.
Хотя могут возникнуть вопросы относительно стоимости, результаты действительно подчеркивают, как редактирование генов переходит от многообещающей технологии с некоторыми существенными проблемами к чему-то, что мы можем использовать для создания множества терапевтических средств. И хотя все еще существует множество ограничений в том, как мы можем применять эти первоначальные подходы следующего поколения, очевидно, что существует множество дополнительных идей, которые могут привести к созданию поколений, выходящих за рамки этих.
Природа, 2026. DOI: 10.1038/s41586-026-10342-9 (О DOI).
Источник: arstechnica.com
