В сотрудничестве с Австрийским институтом науки и технологий (ISTA) мы опубликовали в журнале Nature первый в истории метод использования световой микроскопии для всестороннего картирования всех нейронов и их связей в блоке мозговой ткани. Ключевым результатом этого эксперимента по проверке является то, что этот подход работает так же хорошо, как и коннектомика на основе электронной микроскопии.
Быстрые ссылки
- Бумага
- Делиться
В 1660-х годах голландский торговец тканями Антуан ван Левенгук, с помощью простого самодельного светового микроскопа, увеличивавшего образцы более чем в 250 раз, первым задокументировал детальное изображение бактерий, эритроцитов, сперматозоидов и многих других научных объектов. С тех пор световая микроскопия прочно закрепилась в качестве основополагающего метода в нашем стремлении понять живые организмы. Сегодня она практически повсеместно используется в биологических лабораториях, позволяя биологам идентифицировать и характеризовать клетки, органы и ткани, а также диагностировать многие заболевания.
Однако одна область, в которую световая микроскопия пока не смогла проникнуть, — это коннектомика, область нейробиологии, в которой Google внесла фундаментальный вклад за последнее десятилетие. Попытки всесторонне картировать все нейроны в определенной области — включая наши предыдущие работы по коннектомике — вместо этого опирались на метод электронной микроскопии, который позволяет получить чрезвычайно детальное представление о структурной информации внутри клетки. Однако у электронной микроскопии есть существенный недостаток: она требует дорогостоящего, высокоспециализированного оборудования, которое не всегда доступно большинству нейробиологических лабораторий.
Сегодня в сотрудничестве с коллегами из Австрийского института науки и технологий (ISTA) мы опубликовали в журнале Nature статью «Коннектомическая реконструкция ткани головного мозга млекопитающих на основе световой микроскопии», в которой мы описываем первый в истории метод использования световой микроскопии для всестороннего картирования всех нейронов и их связей в блоке ткани головного мозга мыши. Мы достигли этого, адаптировав несколько хорошо зарекомендовавших себя и проверенных методов и объединив их в единый рабочий процесс, который мы называем LICONN (коннектомика на основе световой микроскопии). Наши коллеги из ISTA возглавили ключевое нововведение проекта — протокол, который физически расширяет ткань головного мозга, сохраняя при этом структурную целостность, и одновременно химически метит все белки, чтобы обеспечить контраст изображения, необходимый для отслеживания нейронов и обнаружения других клеточных структур, таких как синапсы.
Мы совместно с ISTA доработали детали протокола, применив наш набор инструментов анализа изображений и машинного обучения (МО) для коннектомики, и в конечном итоге подтвердили работоспособность LICONN в масштабе, обеспечив автоматическую реконструкцию объема коры головного мозга мыши, составляющего почти миллион кубических микрон. Затем мы всесторонне проверили прослеживаемость всех ~0,5 метров нейритов, упакованных в меньший объем ткани гиппокампа мыши, продемонстрировав, что LICONN работает сопоставимо с коннектомикой на основе электронного микроскопа. Мы также показали, что LICONN открывает возможность одновременного измерения структурной и молекулярной информации в образце ткани, что позволит получить принципиально новые возможности для понимания работы мозга.
Коннектомика использует микроскопическую визуализацию в сочетании с вычислительной обработкой для реконструкции отдельных клеток и их сложных связей в тканях головного мозга.
Необходимость новых подходов
Электронные микроскопы создают изображения на основе рассеяния пучка электронов при взаимодействии с образцом, что позволяет им иметь гораздо более высокое разрешение, чем световая микроскопия — они могут отображать детали в масштабе нанометра по сравнению с сотнями нанометров для (видимой) световой микроскопии. Но, несмотря на ограниченное разрешение световой микроскопии, ее доступность является большим преимуществом. Электронные микроскопы, используемые в коннектомических исследованиях, могут стоить миллионы долларов, а работа с ними требует обширной специализированной подготовки, что часто делает их доступными только для нейробиологов в крупных, хорошо финансируемых учреждениях.
Исследователи использовали ряд методов «сверхразрешающей» световой микроскопии, позволяющих получать изображения за пределами дифракционного предела света и достигать наноразмерного разрешения, для маркировки и отслеживания относительно небольших групп нейронов различными способами. Однако эти методы не смогли обеспечить «плотную» коннектомику — то есть картирование всех плотно упакованных нейронов в масштабе мельчайших волокон.
Ключевое преимущество световой микроскопии заключается в том, что она может улавливать свет на многих различных длинах волн, поэтому исследователи могут использовать ее для визуализации целого спектра флуоресцентных маркеров для белков, нейромедиаторов и других молекул, которые дают представление о том, как функционируют или нарушаются нейроны и нейронные цепи. LICONN открывает возможность сопоставлять эти молекулярные маркеры с подробными структурными картами нейронных путей с беспрецедентной точностью и легкостью, что поможет получить важные сведения о том, как мозг генерирует познание, восприятие и поведение.
Расширение возможностей
Чтобы обойти проблему ограниченного разрешения световой микроскопии, наши коллеги из ISTA сосредоточили свои усилия на самом образце. Они использовали метод, называемый экспансивной микроскопией, в котором используется вещество, называемое гидрогелем (тот же материал, который делает подгузники впитывающими). Гидрогели поглощают влагу путем образования поперечных связей с молекулами воды, набухая при этом — принцип, на который опирались исследователи из лаборатории Бойдена в Массачусетском технологическом институте при разработке протокола экспансии тканей для микроскопии в 2015 году.
Хотя микроскопия с расширением тканей сегодня используется во многих лабораториях, существующие протоколы расширения тканей не обеспечивают достаточной сохранности ткани для отслеживания плотно меченых нейронных структур, поэтому наши сотрудники из ISTA разработали новый протокол расширения для LICONN. Он включал в себя сначала разрезание крошечного блока ткани на секции по 50 микрометров, а затем обработку каждой секции последовательностью из трех различных гидрогелей. Два из гидрогелей создавали отдельные, переплетающиеся полимерные сети внутри ткани, каждая из которых увеличивала объем ткани в четыре раза, а третий гидрогель служил для стабилизации этих сетей. При использовании этого протокола ткань расширялась примерно в 16 раз в каждом направлении, что приблизительно сравнимо с тем, как если бы вы начали с кубика сахара и закончили коробкой салфеток.
Чтобы сделать нейроны видимыми, наши коллеги инкубировали срезы мозговой ткани с зеленым флуоресцентным красителем, фактически «маркируя» все белки внутри клеток. В некоторых образцах они также использовали несколько других красителей, которые нацелены на определенные белки, нейромедиаторы или другие молекулы, важные для определения типа или функции нейрона.
Каждый срез ткани представляет собой, по сути, последовательный срез толстого слоя нейронов, переплетенных с другими клетками, такими как глиальные клетки. Отслеживание этой плотной массы фрагментов клеток мозга в разросшейся ткани может быть сложной задачей. Мы решили эту проблему, используя алгоритмы, которые мы ранее разработали для автоматической реконструкции нейронов на нескольких срезах ткани. Эти инструменты достигли высочайшей точности в разграничении отдельных структур на изображениях ткани мозга, полученных с помощью электронной микроскопии (сети заполнения), а также в выравнивании и сшивании последовательных изображений электронной микроскопии (SOFIMA).
Проверка работоспособности LICONN
Главная цель нашего исследования заключалась в демонстрации того, что LICONN столь же надежен, как и коннектомика, основанная на электронной микроскопии. Во-первых, мы показали, что наши результаты точно совпадают с ручным обведением всех разветвленных дендритов и тонких, извилистых аксонов в пределах участка ткани. Затем мы обучили наш автоматизированный алгоритм реконструкции на данных, полученных вручную. После оптимизации точности алгоритма мы показали, что он работает сопоставимо с реконструкциями, полученными на основе данных электронной микроскопии.
Визуализация реконструированного объема LICONN с автоматической сегментацией из сетей заполнения пустот. На изображении показана реконструкция 5,8% аксонов ( сверху ) и 27,3% дендритов и небольшого количества аксонов ( снизу ) из исходного объема ткани.
Далее мы подтвердили, что синаптические связи надежно идентифицируются в объемах LICONN. Мультимодальные возможности LICONN — одновременная визуализация структуры (морфологии), связности, а также конкретных интересующих нас молекул в одном и том же образце — позволили нам напрямую маркировать специфические белки, которые отличают пресинаптические области от постсинаптических в ткани. Кроме того, мы смогли использовать эти метки в качестве эталонных данных для обучения алгоритмов машинного обучения идентификации этих синаптических областей исключительно на основе структурных наблюдений, как это делается в коннектомике электронной микроскопии.
Наконец, мы также использовали мечение белков для выявления молекулярной информации на коннектомических картах, которую невозможно достоверно получить только из структуры, тем самым значительно выйдя за рамки возможностей коннектомики электронной микроскопии. Например, мечение белков, связанных с двумя различными нейромедиаторами, позволило нам напрямую дифференцировать тормозные и возбуждающие синапсы. Мечение еще одного белка позволило точно определить электрические синапсы, которые повсеместно распространены в нервной системе, но обычно игнорируются при коннектомических реконструкциях на основе электронной микроскопии из-за их небольшого и незаметного структурного вида. Возможность однозначно идентифицировать эти молекулярные особенности в ткани мозга и поместить их в контекст общей морфологии и связности мозга значительно расширит возможности коннектомических карт.
Трехмерная визуализация и увеличенные изображения дендрита (сегментированного с помощью сетей, заполняющих пространство) и возбуждающих синаптических связей (белые полосы), обнаруженных с помощью иммуномечения .
В нашем исследовании исследованный нами участок мозга мыши составлял лишь небольшую часть от блока ткани человеческого мозга площадью 1 квадратный миллиметр (примерно размером с рисовое зернышко), который мы вместе с коллегами из Гарвардского университета исследовали в прошлом году с помощью коннектомики на основе электронной микроскопии. В настоящее время мы работаем над масштабированием LICONN, чтобы иметь возможность получать данные из больших объемов ткани.
Предстоящий путь
Недавно мы объявили о совместной работе по картированию мозга мыши, начиная с гиппокампа — это один из нескольких проектов в области коннектомики, финансируемых Национальными институтами здравоохранения. Мы также работаем над пониманием того, как изменяются структуры мозга в контексте таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера. Однако для полного достижения этих целей потребуются инновации, которые сделают картирование мозга на порядки более эффективным.
Подтверждение работоспособности LICONN является явным шагом на пути к этой цели, открывая большие перспективы как для повышения доступности коннектомики, так и для получения учеными «мультимодальных» коннектомов, объединяющих информацию о нейронах и синапсах с молекулярными деталями, которые ранее были недоступны. Полезность LICONN для нейробиологического сообщества подтверждается тем фактом, что уже несколько лабораторий успешно воспроизвели методику, основанную на нашем препринте, впервые опубликованном в марте 2024 года. Мы рассматриваем эту работу как шаг к достижению высоких целей нейробиологии, которые могут открыть важные возможности для применения в клинической практике и за ее пределами.
Благодарности
Мы благодарим наших научных сотрудников из лаборатории Данцля (ISTA) и отмечаем существенный вклад команды Connectomics в Google. Мы благодарны Алле Кацнельсон и Элизе Клеман за их помощь. Благодарим Лиззи Дорфман, Майкла Бреннера, Джона Платта и Йосси Матиаса за их поддержку, координацию и руководство.
Источник: research.google
